Ärzte Zeitung, 18.03.2016

CRISPR-Cas9

Eine Gentechnik erobert die Welt

Im Eiltempo hat eine neue Methode die Gentechnik-Labors der Welt erobert: CRISPR-Cas9. Für die Erforschung des Systems wurden jetzt die Professorinnen Dr. Emmanuelle Charpentier und Dr. Jennifer Doudna mit dem Paul-Ehrlich-Preis geehrt.

Von Peter Leiner

Eine Gentechnik erobert die Labors

Paul Ehrlich- und Ludwig Darmstaedter-Preis 2016 an Emmanuelle Charpentier (re.) und Jennifer A. Doudna. Claus-Dieter Kuhn erhielt den Nachwuchspreis.

© Paul-Ehrlich -Stiftung / Uwe Dettmer

FRANKFURT/MAIN. Für Professor Jörg Hacker, Präsident der Deutschen Akademie der Naturforscher Leopoldina - Nationale Akademie der Wissenschaften, ist das gentechnische Verfahren CRISPR-Cas9 eines der erfolgreichsten der Molekularbiologie der vergangenen zehn oder gar 20 Jahre, wie er bei der Verleihung des mit 100.000 Euro dotierten Paul Ehrlich- und Ludwig Darmstaedter-Preises in der Frankfurter Paulskirche am 14. März hervorhob.

Mit dieser Auszeichnung sind in diesem Jahr, wie berichtet, die Professorinnen Dr. Emmanuelle Charpentier, seit Kurzem Direktorin am Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin, und Dr. Jennifer Doudna von der Universität in Berkeley geehrt worden.

Die Entwicklung dieser neuen Genomtechnik sei ein Ereignis, dessen Bedeutung man vielleicht mit jener der Polymerasekettenreaktion PCR zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren vergleichen könne, so Hacker, der auch Mitglied des Paul Ehrlich-Stiftungsrats ist. Er betonte, dass die Entwicklung dieser neuen Technik aus der Grundlagenforschung erwachsen sei.

Tatsächlich entdeckt wurde der RNA-Protein-Komplex CRISPR-Cas9 - lapidar als Genschere bezeichnet - in Bakterien, die sich damit nach einer Infektion mit Bakteriophagen vor weiteren Angriffen schützen: gewissermaßen ein erworbenes Immunsystem, das die eindringende fremde DNA - stamme sie von Phagen oder auch von Plasmiden - zerkleinert und damit unschädlich macht. Allerdings nutzt nicht jede Bakterienart diesen Abwehrmechanismus.

Andere verwenden DNA-schneidende Restriktionsenzyme, deren Entdeckung den Beginn der Molekularbiologie markiert hat. Die US-Amerikanerin Doudna und die Französin Charpentier haben nach Forschungen mit Streptokokken erkannt - darunter der Scharlacherreger Streptococcus pyogenes -, dass sich dieses System nutzen lässt, mithilfe definierter RNA-Sequenzen gezielt DNA-Abschnitte im zellulären Erbgut anzusteuern und zu verändern. Und das wurde inzwischen erfolgreich an tierischen und pflanzlichen Zellen sowie etwa an menschlichen Epithelzellen erprobt.

Eine einfach anwendbare Methode

Das Bestechende an dieser neuen gentechnischen Methode, die innerhalb von nur wenigen Jahren eine sehr weite Verbreitung unter den Wissenschaftlern gefunden hat, ist ihre Einfachheit und leichte Anwendbarkeit - möglicherweise selbst im "Do-it-yourself"-Bereich von Menschen, die wenig molekularbiologisches Vorwissen haben.

"In den USA wird bereits ein Bausatz sogar für Heranwachsende angeboten", so Doudna im Gespräch mit der "Ärzte Zeitung". Nach dem Motto: "Bastele dir dein eigenes Bakterium." Wie gut er funktioniert, kann die Chemikerin nicht sagen. "Ich habe diesen CRISPR-Kit noch nicht ausprobiert."

Kritiker erinnern daran, dass es bei der Anwendung der Technik zu Fehlern kommen kann, weil die Genschere nicht an der gewünschten Stelle schneidet. Doudna glaubt jedoch nicht, dass das die weitere Entwicklung der Methode behindern könnte. Risiken möchte sie jedoch nicht komplett ausschließen. "Deshalb brauchen wir noch mehr Forschung dazu."

Auch Charpentier, die innerhalb von sieben Jahren drei Labors gegründet hat, prüft derzeit, wie sich unerwünschte Wirkungen der Methode minimieren lassen.

Vielleicht trägt ein neues CRISPR-System dazu bei, das sie mit ihren Kollegen entdeckt hat und das statt Cas9 ein anderes Enzym enthält, wie sie der "Ärzte Zeitung" sagte.

"Das ist ein sehr interessantes Enzym mit einem einzigartigen Mechanismus." Noch steht die Publikation der Ergebnisse allerdings aus.

Kombination mit der Zelltherapie?

Die rasche weite Verbreitung des CRISPR-Cas9-Methode ist auch mit großen Hoffnungen verknüpft, die Methode eines Tages nicht nur in der Grundlagenforschung, sondern auch therapeutisch zu nutzen.

Im Tierversuch waren Wissenschaftler bereits erfolgreich, unter anderem bei Mäusen mit Duchennescher Muskeldystrophie, bei denen durch die Behandlung defekte Dystrophinmoleküle durch intakte ersetzt wurden. Wie Charpentier sagte, erforschten derzeit Wissenschaftler an der von ihr mitbegründeten Biotech-Firma CRISPR Therapeutics die Methode für die Anwendung bei verschiedenen Krankheiten, darunter Mukoviszidose und Sichelzellanämie.

Wann das Verfahren erstmals in klinischen Studien geprüft werden kann, hängt davon ab, wie rasch dessen Entwicklung fortschreitet. "In dieser Hinsicht sind manche meiner Kollegen optimistischer als andere. Aber ich denke, der Optimismus überwiegt", so Charpentier.

Letztlich werde es durch eine Kombination einer Gentherapie mit der Zelltherapie umgesetzt. Wie bei der Immuntherapie mit CAR-T-Lymphozyten würden Zellen von Patienten entnommen, ex vivo gentechnisch per CRISPR verändert und dann reinfundiert. "Es gibt keinen Grund, warum das nicht möglich sein sollte." Noch bestehe derzeit die Schwierigkeit, die Technik an ausreichend vielen Zellen anzuwenden.

Die Herstellung von CRISPR-Cas9 ist das eine, das Einschleusen des Komplexes in Zellen zur Veränderung des Erbgutes ist das andere. Nach Angaben von Charpentier gibt es aber eine ganze Reihe von Möglichkeiten, mit denen sich das realisieren lässt. Als Beispiel nannte sie Lentiviren und adenosassoziierte Viren, Nanopartikel und Plasmide.

Auch die direkte Injektion von Boten-RNA mit dem Bauplan für das CRISPR-Enzym sei möglich. Bei bestimmten Zellen, auch menschlichen, lasse sich schließlich auch die Elektroporation verwenden, bei der durch kurze elektrische Impulse die Zellmembran für das Durchschleusen des Komplexes vorbereitet wird.

Nachdem im vergangenen Jahr in China die CRISPR-Technik erstmals weltweit bei menschlichen - allerdings nicht lebensfähigen - Embryonen eingesetzt worden war, ist es seit Anfang des Jahres in Großbritannien erlaubt, das Verfahren bei menschlichen Embryonen bis zum Alter von 14 Tagen anzuwenden.

Die Wissenschaftlerin Dr. Kathy Niakan am Francis Crick Institute in London will mithilfe der Technik die Embryonalentwicklung bei Menschen besser verstehen.

Forschung an Embryonen

Doudna: "Was die Forscher in China gemacht haben, war in Übereinstimmung mit dem Konsensus-Statement des International Summit on Human Gene Editing in Washington im Dezember vergangenen Jahres, weil sie sich an die Richtlinien ihres Landes gehalten haben."

Außerdem sei es reine Grundlagenforschung gewesen, ohne das Ziel, die Embryonen nach dem "Genome Editing" in einen Uterus zu übertragen. "Ich weiß allerdings nicht, wie viel sie daraus gelernt haben." Doudna begrüßt Niakans Forschung an Embryonen: "Ich mache solche Forschungsarbeiten zwar selbst nicht, erwarte aber sehr interessante Daten aus dieser Forschung."

Weil die CRISPR-Methode so einfach anwendbar ist und das auch bei menschlichen Zellen, wird bereits viel über mögliche Anwendungen zur Keimbahntherapie diskutiert, durch Veränderung der Spermien, der Oozyten oder von embryonalen Stammzellen.

Doudna und Charpentier haben eine eindeutige Position dazu bezogen. Beide sind gegen eine Anwendung dieser Therapievariante. Doudna: "Die Keimbahntherapie bei Menschen lehne ich strikt ab. Ich denke, wir sollten derzeit nicht in diese Richtung gehen." Die US-Amerikanerin hatte das Abschlussdokument der Tagung in Washington als Mitorganisatorin unterzeichnet.

Kaum noch Zeit für die Forschung

Doudna und Charpentier haben in der letzten Zeit weltweit sehr viel Aufmerksamkeit erfahren. Die Französin, die im vergangenen Jahr vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung mit Wissenschaftlern ihrer Forschergruppe an das Max Planck-Institut für Infektionsbiologie gewechselt ist, hat aufgrund des großen Interesses an ihrer Forschung im Moment wenig Zeit, selbst Grundlagenforschung zu betreiben.

Mit ihrer Forschungsgruppe in Berlin untersucht sie nicht nur das CRISPR-System, sondern auch andere Mechanismen in Bakterien auf molekularer Ebene, um die Produktion verschiedener Faktoren besser zu verstehen, zum Beispiel Virulenz- und Adhäsionsfaktoren. "Wir hoffen dadurch weiter aufzuklären, wie Bakterien Krankheiten verursachen." Der Fokus liege dabei auf Humanpathogenen wie Streptococcus pyogenes und Listerien.

Der Erfolg durch die CRISPR-Cas9-Entwicklung hat auch Doudnas Forscherleben verändert. "Ich interessiere mich heute viel stärker als früher dafür, welche Auswirkungen Wissenschaft und Technologie auf die Gesellschaft haben." Dadurch habe sie sich zum Beispiel intensiv mit der menschlichen Embryonalentwicklung beschäftigt. "Da war ich überhaupt kein Experte."

In ihrem Labor in Berkeley erforscht sie mit ihren Kollegen das CRISPR-System ganz allgemein. "Wir fragen uns außerdem, wie virale DNA in das bakterielle Chromosom integriert wird. Und wir untersuchen andere CRISPR-Systeme als das Cas9-System, also mit anderen Enzymen, um zu sehen, wie die wirken." Ein weiterer Schwerpunkt ihrer Forschung ist die RNA-Interferenz in Eukaryonten, also das Stummschalten von Genen durch doppelsträngige RNA-Moleküle.

"Die Entwicklung der programmierbaren CRISPR-Cas9-Genschere ist faszinierend, spannend und zukunftsweisend zugleich", sagte Gesundheitsminister Hermann Gröhe in seinem Grußwort zur Verleihung des Paul-Ehrlich-Preises. "Mit ihr verbinden sich große Chancen und riesige Hoffnungen auf Heilung für schwer erkrankte Menschen.

Sie ist eine Hoffnung auf bessere Therapien und damit auf eine Verbesserung der Lebensqualität." Gleichzeitig müssten wir uns aber über die mögliche Tragweite bewusst sein, die eine solche Technik haben könne, wenn sie nicht verantwortungsbewusst eingesetzt werde.

"Wir brauchen klare Regeln"

Gröhe weiter: "Deshalb brauchen wir bei aller Fortschrittsfreude stets auch klare Regeln, die von der Wissenschaft beachtet werden. Mit dem Embryonenschutzgesetz haben wir für Deutschland einen ganz klaren Rechtsrahmen, der besagt, dass Keimbahninterventionen am Menschen verboten sind."

Sowohl im nationalen als auch im internationalen Rahmen beobachte die Bundesregierung die Entwicklung auf diesem Gebiet sehr genau. "Besonderes Augenmerk legen wir dabei neben der wissenschaftlichen Entwicklung auch auf deren ethische, rechtliche und soziale Konsequenzen", so der Gesundheitsminister.

RNA-Forschung für die künftige Diagnostik

Der Biochemiker PD Dr. Claus-Dieter Kuhn ist in der Welt der RNA-Moleküle zu Hause - und will sie für die Diagnostik nutzen.

Ärzte Zeitung: Herr Dr. Kuhn, wie würden Sie ganz einfach das beschreiben, wofür Sie mit dem Paul-Ehrlich-Nachwuchspreis ausgezeichnet worden sind?

Dr. Claus-Dieter Kuhn: Die Auszeichnung ist für Forschungsarbeiten an Proteinen, die mit RNA-Molekülen interagieren, die nicht für Proteine kodieren, also keine Bauanleitung für Eiweißmoleküle haben. Argonaute ist ein Beispiel dafür. Es ist ein Molekül, das an RNA-Moleküle bindet und sie ausschaltet.

RNA-Polymerase I ist dagegen ein Enzym, das RNA herstellt. Schließlich kontrolliert das sogenannte CCA-addierende-Enzym Transfer-RNA-Moleküle, bevor ihre Aktivität zur Entstehung fehlerhafter Proteine führt.

Wie kamen Sie auf die Idee, RNA-Moleküle, die nur regulierend wirken und keinen Bauplan für Proteine haben, genauer unter die Lupe zu nehmen?

Kuhn: Als ich meine Doktorarbeit im Jahre 2008 beendet hatte, war die RNA-Interferenz in menschlichen Zellen, also das Ausschalten von Boten-RNA durch mikroRNAs, ein weltweit intensiv erforschtes, jedoch noch wenig verstandenes Forschungsgebiet.

Da ich in meiner Dissertation schon begonnen hatte, an Protein-RNA-Komplexen zu arbeiten, war es deshalb ein logischer Schritt, ein RNA-bindendes Protein zu bearbeiten, das an eine nicht kodierende RNA bindet.

Sie sind Biochemiker und zugleich Strukturbiologe. Ist Biochemie ohne Strukturbiologie heute nicht mehr denkbar?

Kuhn: Ich denke nicht, dass Biochemie bzw. Strukturbiologie jeweils das einzig Wahre ist. Wir Strukturbiologen können kaum neue Interaktionen zwischen gesunden und kranken Proteinen und RNAs in unseren Zellen entdecken. Dafür brauchen wir die Systembiologie und Biochemie.

Die Strukturbiologie ist eher die Nachhut, die das, was in der Biochemie entdeckt wurde, tiefer durchdringt und auf molekularer Ebene erklärt. Dieses tiefe Verständnis ist nötig, um z.B. mit neuen Wirkstoffen in zelluläre Prozesse eingreifen zu können.

So war das auch bei der Erforschung von CRISPR-Cas9, dem Forschungsthema der beiden diesjährigen Paul-Ehrlich-Preisträgerinnen. Zunächst wurden die dazugehörigen RNA-Moleküle entdeckt, aber es wurde erst einmal nicht verstanden, was sie genau machen. Erst nachdem die Struktur aufgeklärt war, wurde klar, dass die RNA-Moleküle helfen, doppelsträngige DNA zu schneiden.

RNA-Moleküle sind Ihre Lieblingsforschungsobjekte: Haben Sie noch den Überblick über die vielen RNA-Arten?

Kuhn: Nein, ich denke nicht. Jedoch glaube ich nicht, dass man da einen kompletten Überblick haben muss. Ich denke nämlich, dass wir Menschen alle RNAs nur deshalb in Klassen einteilen, weil wir Menschen sind, aber ich bin sicher, dass unsere Zellen dies gar nicht tun. Zellen interessiert nur, welche Funktionen ein Molekül ausführt.

Ich erwarte daher, dass es viele Überschneidungen der Wirkweisen von RNA-Molekülen gibt. Wenn zum Beispiel in einer humanen Zelle eine sogenannte piRNA benutzt wird, um irgendein Gen auszuschalten, könnte dieselbe Funktion in einem anderen Organismus z.B. eine lincRNA übernehmen.

Ich erwarte also, dass die Regulation durch RNA konserviert ist, jedoch nicht die Klassen an RNA-Molekülen, die diese ausführen.

Nutzen Sie für Ihre Forschung die Systembiologie?

Kuhn: Wir nutzen die Systembiologie, etwa, um genomweite Ziele von kleinen RNA-Molekülen zu bestimmen. Die Funktion der meisten neu entdeckten nicht-kodierenden RNAs kann allerdings nicht so einfach bestimmt werden, da diese RNAs sehr groß sind und komplexe Strukturen aufweisen.

Sie haben sich auch intensiv mit dem Eiweißmolekül Argonaute-2 beschäftigt. Was hat es damit auf sich?

Kuhn: Das Protein Argonaute-2 bindet nicht-kodierende mikroRNAs und benutzt diese kleinen RNAs, um Boten- RNAs zu erkennen, welche komplementäre Sequenzen aufweisen. Nach der Erkennung einer Boten-RNA leitet Argonaute-2 dann deren Abbau ein.

Was Sie machen, ist zunächst reine Grundlagenforschung. Wo sehen Sie schon heute mögliche therapeutische oder diagnostische Ansätze, zum Beispiel bei Mikro-RNAs?

Kuhn: Diagnostische Ansätze sehe ich als vielversprechender an. Wenn man zum Beispiel in Gewebeproben von Krebspatienten mit einem besonders aggressiven Tumor feststellt, dass eine bestimmte nicht-kodierende RNA im Vergleich zu einem anderen Patienten überrepräsentiert ist, kann man vermuten, dass diese RNA ein Marker für aggressive Tumoren ist.

Hier sehe ich eine direktere Anwendbarkeit von RNA-Forschung als im therapeutischen Bereich, weil wir nämlich mithilfe von RNA-Forschung sicherstellen könnten, dass nur der Patient eine Therapie bekommt, dem diese auch wirklich helfen wird. Wir kennen heute eine Menge nicht-kodierender RNAs, von denen wir überhaupt noch nicht wissen, was sie in der Zelle machen.

Trotzdem können wir diese verwenden, um Krebsarten zu klassifizieren und eine Therapie danach auszurichten. Ein Beispiel sind hier nicht-kodierende lincRNAs, die sich im Urin nachweisen lassen.

Das Interview führte Peter Leiner

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