Polymerasekettenreaktion - was reagiert da?
Alle Welt redet vom Nachweis von SchweinegrippeViren. Das geht mit einer molekularbiologischen Methode innerhalb weniger Stunden. Doch wie funktioniert die sogenannte Echt-Zeit-PCR (Polymerase-Kettenreaktion) eigentlich?
Veröffentlicht:"Das Virus der Neuen Influenza A/ H1N1 lässt sich durch eine Polymerasekettenreaktion, kurz PCR, zuverlässig nachweisen", sagte Dr. Barbara Biere, stellvertretende Leiterin des Nationalen Referenzzentrums für Influenza des Robert Koch-Instituts, im Gespräch mit der "Ärzte Zeitung". "Das ist eine besonders schnelle, sensitive und spezifische Methode. Aber ein paar Stunden braucht sie schon, denn sie besteht aus mindestens drei Schritten."
Der erste Schritt ist die Extraktion der Nukleinsäuren aus der Probe: Dabei wird die Virenmembran mit Pufferlösung zerstört, das Genmaterial auf einer Matrix fixiert, und die nicht benötigten Virusbestandteile werden ausgewaschen. "Das dauert etwa ein bis zwei Stunden", so Biere. Im zweiten Schritt wird die Viren-RNA in komplementäre DNA (cDNA) "umgeschrieben". Denn die DNA-Polymerase, das entscheidende Reagens der PCR, kann nur mit DNA arbeiten.
Alle weiteren Vorgänge sind auf einen genau definierten Abschnitt im Genmaterial der Schweinegrippe-Viren abgestimmt und finden nur statt, wenn diese vorhanden sind. So wird der ausgewählte Genombereich der Viren im dritten Schritt, der eigentlichen PCR, amplifiziert, also millionenfach vermehrt. Das geschieht in speziellen Geräten, den Thermocyclern: Zunächst wird die DNA durch Temperaturen um 95°C in Einzelstränge getrennt.
Dann kommen die Primer ins Spiel: "Primer sind kurze Nukleinsäure-Sequenzen, die sich an die DNA-Stränge anlagern", so die Molekularbiologin, "aber nicht genau gegenüber, sondern bei der Real-Time-PCR um etwa 100 bis 150 Basen versetzt."
Die beiden Primer begrenzen den Abschnitt des Virusgenoms, der vermehrt werden soll, vorn und hinten. Die Polymerase baut im Reaktionsansatz als Reagens enthaltene Nukleinsäure-Bausteine an die Primer-Enden an. Unter genau definierten Temperatur- und Zeitbedingungen im Thermocycler werden so bis zu 45 Amplifikationszyklen gemacht, in denen der definierte Genomabschnitt jeweils verdoppelt wird.
Die auf diese Weise potenziell vermehrte Erbinformation der Viren könnte nun durch einen vierten Reaktionsschritt, eine Elektrophorese, nachgewiesen werden. "Bei der Real-Time-PCR ist aber dieser vierte Schritt nicht nötig, da die Amplifikation bereits während der PCR-Reaktion - eben ‚real time‘ - angezeigt wird", lobte Biere: "Dafür wird ein weiterer kurzer Nukleinsäure-Abschnitt, die sogenannte Sonde, direkt bei der PCR mitgeführt. Sie ist mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und bewirkt ein Farbsignal, sofern eine Amplifikation stattfindet. Auf diese Weise sind sogar quantitative Bestimmungen möglich."
Bei den sogenannten One-Step-Methode der Real-Time PCR finden übrigens gleich sämtliche Vorgänge ab der Synthese der cDNA in einem Röhrchen statt, das bringt weitere Zeitersparnis. Trotzdem dauert alles zusammen etwa zwei bis drei Stunden, welche man zu den ein bis zwei Stunden der Proben-Aufreinigung hinzurechnen muss.
"Dazu kommen noch Transport und Befundübermittlung", rechnete die Wissenschaftlerin vor: "Wenn nur wenige Proben anfallen, kann das Ergebnis am Nachmittag des Tages vorliegen, sonst aber erst am nächsten Tag."
PCR-Nachweis der Neuen Influenza A/H1N1
Das Nationale Referenzzentrum für Influenza nimmt täglich bis zu 120 PCR-Nachweise der Neuen Influenza A/H1N1 vor. Die eingehenden Proben stammen aus dem nationalen SurveillanceSystem der Arbeitsgemeinschaft Influenza (AGI). Ärzte, die nicht in der AGI mitarbeiten, werden gebeten, ihre Proben nicht an das Nationale Referenzzentrum für Influenza, sondern an ein Vertragslabor ihrer Region zu schicken. Hinweise zu Diagnostik und Umgang mit Probenmaterial gibt es beim Robert-Koch-Institut: www.rki.de unter Neue Grippe (Schweinegrippe)
